筑起机体免疫长城

【备用的器材】
长满单层的F81细胞1瓶
排枪
排枪配套使用的枪头
加样槽
离心管
96孔细胞培养板两块
【试剂配置】
6%DMEM培养基：DMEM培养基+6%新生牛血清
2%DMEM培养基:DMEM培养基+2%新生牛血清
荧光二抗工作液：将浓缩荧光二抗按照1:50稀释（用样品稀释液稀释50倍，现用现配）
【操作步骤】
用6%DMEM培养基将PK细胞铺96孔板一个（细胞密度为3*105/ml），次日弃上清接毒。
接毒步骤如下：
1.无血清培养基将病毒液作连续10倍的稀释，从100-10-8。
2.将稀释好的病毒接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100微升。
3.放置于37℃吸附1小时后，补入2%DMEM培养基每孔100ul，置于37℃CO2培养箱培养。
4.设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
5.逐日观察，一般需要观察72小时后即可测定荧光。
荧光测定步骤如下：
1.弃掉96孔细胞培养板上清，每孔加入150微升样品稀释液，静置30秒，甩去孔内液体，重复洗3次，吸干水分，不用拍板。
2.每孔加入50微升-20℃的固定液放入-20℃静置20分钟，弃掉上清，不用拍板。
3.同上（第一步）重复洗涤3次，吸干水分，不用拍板。
4.每孔加入一抗工作液50ul，盖上盖板膜，放置于37℃40分钟后，同上（第一步）重复洗涤3次，吸干水分，不用拍板。
5.每孔加入荧光二抗工作液50ul，盖上盖板膜，放置于37℃40分钟后，同上（第一步）重复洗涤3次，吸干水分，不用拍板。
6.观察荧光显微镜并根据下表记录不同稀释度的荧光孔数，之后根据10-1～10-8计算出病毒的TCID50含量。
 例:

LgTCID₅₀=l-d(s-0.5)      
L:最高稀释度的对数
D:稀释度对数之间的差
S:阳性孔比率总和
LgTCID₅₀=l-d(s-0.5) =-1-1*（3.375-0.5）=-3.875
  TCID₅₀=10^-3.875/ml
即：将该病毒稀释10^-3.875接种100ul可使50%的细胞发生病变。   
【注意事项】
（1）切记做不接毒的空白细胞对照。
（2）样稀清洗与加样时要温柔，并从同一个位点加入。
（3）加样槽用前请用一次性塑料手套套住，加不同溶液时更换手套，防止不同溶液的交叉污染。
（4）配制好的荧光二抗避光保存，现配现用，固定液放-20℃ 1h后再使用。
（5）操作过程中的移液、计时和洗涤必须精确，以免影响结果。
（6）被测病毒-20化开后需要及时接毒，不可放置室温；配置好的培养放4℃于30天内使用。
（7）如果不需要TCID₅₀数值，请根据10⁰～10^-8直接观察荧光显微镜即可。
【贮藏与有效期】
低温避光保存，有效期为12个月。
【产品规格】2*96T