牛口蹄疫A型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒使用说明书

     更新时间:2019-06-14       浏览量:
【产品名称】
通用名称:口蹄疫A型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒
英文名称:Liquid-phase Blocking ELISA Kit for Detecting FMDV Type A Antibodies
【规格】96T×2块
【用途】
检测牛血清中的口蹄疫A型抗体,适用于动物疫苗免疫抗体监测。
【储藏与有效期】2~8℃保存,有效期12个月。
 
【主要组份】 
序号 组份名称 数量
1 FMDV-A抗原包被板 96T×2块
2 HRP-A型FMD单抗 12mL×1瓶
3 样品稀释液 20mL×1瓶
4 FMDV-A阴性对照 1.0mL×1管
5 FMDV-A阳性对照 1.0mL×1管
6 单组份TMB 12mL×1瓶
7 终止液 12mL×1瓶
8 浓缩洗涤液(20×) 20mL×1瓶
9 说明书 1份
 
【试验操作】
1、洗涤液配制 
将浓缩洗涤液(20×)用蒸馏水或去离子水稀释成洗涤液(1×),即1份浓缩洗涤液加入19份蒸馏水,配制的洗涤液(1×)作为洗板用。
2、定性检测方案(单孔定性,每板检测92份血清样本)
【操作步骤】
2.1加样:设阴性对照血清(A1B1)和阳性血清(C1D1)各2孔,直接加入50ul/孔对照血清;其它为被检样品孔,预先在相应孔内加入45ul的稀释液,接着加入5ul/孔待检血清;最后,在所有孔内均加入50ul的HRP-O型FMD单抗,被检血清即为1:20稀释。振荡,混匀,37℃温育30分钟。
2.2TMB底物:用洗涤液洗板3遍,最后一次拍干,加入TMB底物,50ul/孔,37℃温育15分钟。
2.3反应终止: 加入终止液,50ul/孔,终止反应。
2.4读值:酶标仪450nm波长读数。
 
【计算方法】
2.5阻断率计算
阴性对照平均值=(OD-A1+OD-B1)/2;
阳性对照平均值=(OD+C1+OD+D1)/2;
样品阻断率 PI=[(阴性对照平均值-样品OD值)/阴性对照平均值]×100%
根据以上公式计算被检样品和阳性对照样品的阻断率。
   2.6试验成立
    两孔阴性对照OD450nm值至少一孔OD值大于0.5;两孔阳性对照至少一孔的阻断率大于60%。
【结果判定】
被检样品PI≥50%判为口蹄疫病毒A型抗体阳性;PI<50%判为口蹄疫病毒A型抗体阴性。
3检测方案(每板检测10或20份血清样本)
在使用前,所有的试剂盒组份应恢复到室温。试剂应轻轻旋转或振荡混匀。每个样品使用一个单独的吸头。
3.1样品稀释: 取出FMD-O抗原包被板,根据不同的需要,选择图1或图2中的一种布局进行操作。图1为可检测10份样品布局图;图2为可检测20份样品布局图。每次试验,每板均需设置阴阳性血清对照及4孔不加血清单抗对照。
以图1为例操作,A1~A10每孔各加75µL的稀释液,其它所有孔内各加入50µL的稀释液。A1~A10每孔各加25µL的待检样品,A11孔加50µL的阳性对照,A12孔加50µL的阴性对照,用排枪吹打混匀(每孔吹打3~5次),待检样品A1~A10分别以50µL/孔的量从A到H连续2倍稀释;阳性对照A11以50µL/孔的量从A到H连续2倍稀释;阴性对照A12以50µL/孔的量从A到B连续2倍稀释。待检样品在第1~10列从1:4稀释至1:512;阳性对照,从1:2稀释至1:256,由于试剂盒提供的阳性对照已1:4稀释,则变为从1:8稀释至1:1024;阴性对照,从1:2稀释至1:4。
3.2 加入HRP-A型FMD单抗:样品稀释好后,在所有孔内加入50ul的HRP-A型FMD单抗,反应体系即为100µL/孔。加样完毕后,所有稀释度翻倍,待检样品从1:8~1:1024,阳性对照从1:16~1:2048,阴性对照从1:4~1:8,贴封板膜,振荡混匀。将加好样的ELISA反应板置于37℃温育30分钟。
3.3洗板:用230μL(±20μL)洗涤液(1×)洗涤板孔,共洗涤3次。每次洗涤后应弃去孔内的液体。在最后一次洗涤液弃去后,将孔中残留的洗涤液拍干。按50μL/孔加入TMB底物,37℃避光温育10~15min。
3.4读值: 每孔再加50μL终止液终止反应,立即在450nm波长下读取OD值。
 
图1  96孔板检测10份样品布局图 
  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A S1 1:8 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 1:16 1:4
B 1:16                   1:32 1:8
C 1:32                   1:64 空白
D 1:64                   1:128 空白
E 1:128                   1:256  
不加血清单抗
对照
F 1:256                   1:512
G 1:512                   1:1024
H 1:1024                   1:2048
 
图2  96孔板检测20份样品布局图 
  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A S1 1:16 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 1:16 1:4
B 1:32                   1:32 1:8
C 1:64                   1:64 空白
D 1:128                   1:128 空白
E S11 1:16 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 1:256  
不加血清单抗
对照
F 1:32                   1:512
G 1:64                   1:1024
H 1:128                   1:2048
 
 
【结果分析】
3.5试验成立判断
不加血清单抗对照OD值应在2.0±1.2范围内;
阳性对照抗体效价不低于1:1024±1滴度;
阴性对照抗体效价应<1:8。
3.6结果判定
不加血清单抗对照4孔,弃去最高和最低OD值,计算剩余2孔的平均OD值,再除以2,即得50%对照值,该值即为临界值,表示阻断50%反应的对照OD值。待检样品OD值>临界值,判为阴性孔;待检样品OD值≤临界值,判为阳性孔。每份待检样品系列梯度稀释中,阳性孔的最高稀释倍数即为该待检样品的抗体效价。若临界值处于两个稀释孔OD值之间,抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值。如临界值处于1:64(反对数值为1.8)与1:128(反对数值为2.1)之间,则判定该份待检样品的抗体效价为1:90(反对数值为1.95)。
抗体效价≥64,为疫苗免疫合格。
抗体效价计算对照表(反对数值)
抗体效价 Log10(效价)
对照计算
抗体效价 Log10(效价)
对照计算
抗体效价 Log10(效价)
对照计算
1:4 0.6 1:32 1.5 1:256 2.4
1:6 0.75 1:45 1.65 1:360 2.55
1:8 0.9 1:64 1.8 1:512 2.7
1:11 1.05 1:90 1.95 1:720 2.85
1:16 1.2 1:128 2.1 1:1024 3
1:22 1.35 1:180 2.25 1:1440 3.15
 
 
4、注意事项
4.1 为使您的实验获得正确结果,请您在实验前仔细阅读本说明书。
4.2 所有试剂使用前恢复至室温(18~26℃),以免温度过低影响抗原抗体反应。
4.3实验前应用温度计检查温箱温度,温度过高或过低影响OD值高低。
4.4 包被板反应时严禁堆叠放置,应该平铺且板间有空隙,不要离温箱壁太近。
4.5实验所用移液器及设备应定期校准。
4.6采集的样品要新鲜,并且最好不要溶血。血清标本在2~8℃放置不要超过2天,室温不超过8小时,如需长时间放置应储存于-20℃。 
 
【联系人】 王金良                                                   电话:0543-3403060
仅供兽医诊断使用           



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编辑:熊方方




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