犬细小病毒病PCR检测试剂盒说明书（20次）
更新时间：2019-06-10 浏览量：
【注意】 用前请认真阅读注意事项。
【用途】 用于犬细小病毒的检测、诊断和流行病学调查。
【试剂】
反应条件：
【用途】 用于犬细小病毒的检测、诊断和流行病学调查。
【试剂】
【操作步骤】
1. 病料处理
取适量病料（小肠、心、淋巴结）等组织，于灭菌研钵充分研磨，用PBS液按照1：3稀释成均匀乳剂，-20℃反复冻融3次以上。
2. DNA的提取
(1) 取已冻融好的病料，1000rpm离心5min，取上清200μl（或质控样品T，200μl），加25μl TU-1和3μl TU-2，50℃水浴1～2h，期间轻柔振荡几次帮助裂解。
（2）加入200μl SR-I，剧烈颠倒轻摇充分混匀，70℃放置10min。
（3）冷却后加入100μl异丙醇，充分混匀后，加入一个吸附柱（试剂盒内提供）中（吸附柱放入收集管中）10000rpm离心30秒，弃掉收集管中的废液。
（4）加入500μl SR-Ⅱ，10000rpm离心30秒，弃废液。
（5）加入700μl SR-Ⅲ，10000rpm离心30秒，弃废液。
（6）再加入500μl SR-Ⅲ，10000rpm离心30秒，弃废液。
（7）将吸附柱放回空收集管，13000rpm离心2min。
（8）取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加入70μl TU-3（使用前事先预热至65-70℃，有助于提高洗脱效果），室温放置3～5min，12000rpm离心1min，将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
（9）洗脱液即为模板，可放在2～8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。
3. PCR操作
加样体系：将下列试剂加入0.5mLPCR反应管中，最好在冰浴条件下加样。
1. 病料处理
取适量病料（小肠、心、淋巴结）等组织，于灭菌研钵充分研磨，用PBS液按照1：3稀释成均匀乳剂，-20℃反复冻融3次以上。
2. DNA的提取
(1) 取已冻融好的病料，1000rpm离心5min，取上清200μl（或质控样品T，200μl），加25μl TU-1和3μl TU-2，50℃水浴1～2h，期间轻柔振荡几次帮助裂解。
（2）加入200μl SR-I，剧烈颠倒轻摇充分混匀，70℃放置10min。
（3）冷却后加入100μl异丙醇，充分混匀后，加入一个吸附柱（试剂盒内提供）中（吸附柱放入收集管中）10000rpm离心30秒，弃掉收集管中的废液。
（4）加入500μl SR-Ⅱ，10000rpm离心30秒，弃废液。
（5）加入700μl SR-Ⅲ，10000rpm离心30秒，弃废液。
（6）再加入500μl SR-Ⅲ，10000rpm离心30秒，弃废液。
（7）将吸附柱放回空收集管，13000rpm离心2min。
（8）取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加入70μl TU-3（使用前事先预热至65-70℃，有助于提高洗脱效果），室温放置3～5min，12000rpm离心1min，将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
（9）洗脱液即为模板，可放在2～8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。
3. PCR操作
加样体系：将下列试剂加入0.5mLPCR反应管中，最好在冰浴条件下加样。
反应条件：
4. 电 泳
配制1%琼脂糖凝胶，取PCR产物5uL混合1μl TU-7，加样于凝胶孔中，同时在相邻孔加3μl TU-8，在120v 电压下，1×TAE液中电泳15分钟，在紫外成像仪下观察结果。
【结果判定】 在845bp 位置出现扩增带，实验结果为阳性（如图）。
配制1%琼脂糖凝胶，取PCR产物5uL混合1μl TU-7，加样于凝胶孔中，同时在相邻孔加3μl TU-8，在120v 电压下，1×TAE液中电泳15分钟，在紫外成像仪下观察结果。
【结果判定】 在845bp 位置出现扩增带，实验结果为阳性（如图）。
1.DL2000 Marker
2.标准阳性片段
3.阴性对照
【注意事项】
1. 每次使用，开盖之前请先瞬时离心，使试剂沉于管底。
2. 本试剂盒为20头份量试剂，操作失误或移液器不准确造成最终剂量不够情况，不予负责。
3. 所有试剂在要求温度下保存，-20℃保存试剂尽量减少反复冻融，使用后的试剂立即放回，避免在室温搁置太久。
4. 尽量建立PCR试验操作区，避免交叉污染。
5. 加样和反应程序严格按照说明书进行，由于操作失误、移液器不精确、定时不准确造成无结果情况，不予负责。
6. 吸头、离心管和PCR管在使用前，要高压灭菌，操作过程尽量不要用手接触到管内壁，可用镊子夹取。
7. 注意防止试剂污染，在有效期限前用完。
【有效期】
本制品有效期为1年，生产日期见包装内侧。
【联系人】 王金良、管宇 电话：0543-3403060
3.阴性对照
【注意事项】
1. 每次使用，开盖之前请先瞬时离心，使试剂沉于管底。
2. 本试剂盒为20头份量试剂，操作失误或移液器不准确造成最终剂量不够情况，不予负责。
3. 所有试剂在要求温度下保存，-20℃保存试剂尽量减少反复冻融，使用后的试剂立即放回，避免在室温搁置太久。
4. 尽量建立PCR试验操作区，避免交叉污染。
5. 加样和反应程序严格按照说明书进行，由于操作失误、移液器不精确、定时不准确造成无结果情况，不予负责。
6. 吸头、离心管和PCR管在使用前，要高压灭菌，操作过程尽量不要用手接触到管内壁，可用镊子夹取。
7. 注意防止试剂污染，在有效期限前用完。
【有效期】
本制品有效期为1年，生产日期见包装内侧。
【联系人】 王金良、管宇 电话：0543-3403060
仅供兽医诊断使用
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编辑：熊方方
