猪蓝耳病一步法RT-PCR检测试剂盒说明书(20次)

     更新时间:2019-06-06       浏览量:
【注意】  接到货后请认真阅读注意事项。
【用途】  用于猪蓝耳病的检测、诊断和流行病学调查。
【试剂】
【操作步骤】
1.RNA提取  

(1) 取疑似猪蓝耳病的病料(肺脏、淋巴结、脾脏、肾脏等)1~4g于无菌研钵,研磨并用Hanks液或PBS稀释成1:4乳剂,分装1.5ml灭菌EP管,反复冻融2~3次,8000r/min离心5分钟。(血清可直接进行检测,无需冻融)。
(2)取200uL上清液(或标准品T),移入新的1.5mL灭菌EP管中,加入400uLSR-I,反复颠倒几次混匀,室温放置5~10分钟。
(3)加入200uL氯仿,漩涡振荡15秒混匀。室温下放置2~3分钟。
(4)12000r/min离心10分钟,取上层水相(注意:切勿吸取到里两相之间的杂质),转移到一个新的EP管中,再加入等体积异丙醇混匀,室温放置10分钟。
(5)12000r/min离心10分钟,弃去上清,加入SR-II 700uL,充分洗涤沉淀RNA后,12000r/min离心5分钟,小心吸去上清(注意:严格防止RNA丢失)。
(6)用洁净吸水纸吸干管壁的SR-II,室温放置2~3分钟。用20uLTU-5溶解,即为模板,即用或-70℃冻存备用。
2.One-Step RT- PCR加样体系
3.反应程序
4.电泳
称量0.25g琼脂糖,放入锥形瓶,加入25mL 1×TAE液(可配置50×浓缩液,储存备用),于微波炉中熔解,加入1.5uL的TU-8混匀。封闭好电泳槽,加入梳子,倒入琼脂凝胶,待凝固后,将PCR产物5uL混合1uL TU-7,加样于凝胶孔中,同时在相邻孔加3uLTU-6,在120v 电压下,1×TAE液中电泳15分钟,在紫外成像仪下观察结果。

【结果判定】
在约440bp位置出现扩增带,实验结果为阳性(如图)。                              
1.DL2000 Marker      
2.标准阳性片段
【注意事项】
1.每次使用,开盖之前请先瞬时离心,使试剂沉于管底。
2.本试剂盒为20头份量诊断试剂,操作失误或移液器不准确造成最终剂量不够情况,不予负责。
3.所有试剂在要求温度下保存,-20℃保存试剂尽量减少反复冻融,使用后的试剂立即放回,避免在室温搁置太久。
4.尽量建立PCR试验操作区,避免交叉污染,RNA抽提严格防止RNA酶污染,要求戴一次性塑料手套,并经常更换。
5.加样和反应程序严格按照说明书进行,由于操作失误、移液器不精确、定时不准确造成无结果情况,不予负责。
6. 枪头、离心管和PCR管在使用前,最好用DEPC水(0.1%)处理,然后高压灭菌后烘干,操作过程尽量不要用手接触,可用镊子夹取。
7.注意防止试剂污染,在有效期限前用完。
8. TU-8所装试剂为致癌物质,避免接触到皮肤。如若不甚接触,请立即用洗涤剂清洗。
【有效期】
本制品有效期为1年,生产日期见包装侧面。
【联系人】王金良、管宇               电话:0543-3403060
仅供兽医诊断使用



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编辑:熊方方




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