猪增生性肠炎PCR检测试剂盒说明书（10次）
更新时间：2019-06-06 浏览量：
【注意】 用前请认真阅读注意事项。
【用途】 用于猪增生性肠炎的检测、诊断和流行病学调查。
【用途】 用于猪增生性肠炎的检测、诊断和流行病学调查。
【试剂】
【操作步骤】
1. 病料处理
组织样品：取适量小肠、回肠，剥离肠粘膜后，于灭菌研钵充分研磨，用PBS以1：3稀释成均匀乳剂，-20℃反复冻融3次以上，8000 r/min离心5min，取上清。
2. DNA的抽提
2.1组织样品：将组织样品的上清液（或T，T为质控样品）200μl，加50μl SR-I和800μl SR-II，混匀，室温静置10min；涡旋，14000g g/min×1min，弃上清液；加入1 mL 70%乙醇，离心14000g /min×1min，弃上清，本操作重复1次；沉淀中再加入丙酮1mL，离心，14000g/min×1min；沉淀置于56℃干燥15min，加入TU-1 50μl， 离心12000g /min×2min，上清液放入-20℃保存，即为模板。
2.2 粪便样品：称取0.2g粪便，悬浮于900μl SR- II中，涡旋并离心，14000g离心1min，室温静置1h；吸取上清夜置于含有50μl SR-I的离心管中，室温静置10min，涡旋并离心，14000g /min×1 min；加入1 mL 70%乙醇，离心14000g /min×1min，弃上清，本操作重复1次；沉淀中再加入丙酮1mL，离心，14000g/min×1min；沉淀置于56℃干燥15min，加入TU-1 50μl，离心，12000g/min×2min，上清液放入-20℃保存，即为模板。
3.PCR操作
加样体系：
1. 病料处理
组织样品：取适量小肠、回肠，剥离肠粘膜后，于灭菌研钵充分研磨，用PBS以1：3稀释成均匀乳剂，-20℃反复冻融3次以上，8000 r/min离心5min，取上清。
2. DNA的抽提
2.1组织样品：将组织样品的上清液（或T，T为质控样品）200μl，加50μl SR-I和800μl SR-II，混匀，室温静置10min；涡旋，14000g g/min×1min，弃上清液；加入1 mL 70%乙醇，离心14000g /min×1min，弃上清，本操作重复1次；沉淀中再加入丙酮1mL，离心，14000g/min×1min；沉淀置于56℃干燥15min，加入TU-1 50μl， 离心12000g /min×2min，上清液放入-20℃保存，即为模板。
2.2 粪便样品：称取0.2g粪便，悬浮于900μl SR- II中，涡旋并离心，14000g离心1min，室温静置1h；吸取上清夜置于含有50μl SR-I的离心管中，室温静置10min，涡旋并离心，14000g /min×1 min；加入1 mL 70%乙醇，离心14000g /min×1min，弃上清，本操作重复1次；沉淀中再加入丙酮1mL，离心，14000g/min×1min；沉淀置于56℃干燥15min，加入TU-1 50μl，离心，12000g/min×2min，上清液放入-20℃保存，即为模板。
3.PCR操作
加样体系：
反应条件：
4.电 泳
称量0.25g琼脂糖，放入锥形瓶，加入25mL 1×TAE液（可配置50×浓缩液，储存备用），于微波炉中熔解，加入1μl的TU-9混匀。封闭好电泳槽，加入梳子，倒入琼脂凝胶，待凝固后，将PCR产物6μl混合1.5μl TU-10，加样于凝胶孔中，同时在相邻孔加入3μl TU-11，在100V 电压下，1×TAE液中电泳20min，在紫外成像仪下观察结果。
【结果判定】
在295bp 位置出现扩增带，实验结果为阳性（如图）。
称量0.25g琼脂糖，放入锥形瓶，加入25mL 1×TAE液（可配置50×浓缩液，储存备用），于微波炉中熔解，加入1μl的TU-9混匀。封闭好电泳槽，加入梳子，倒入琼脂凝胶，待凝固后，将PCR产物6μl混合1.5μl TU-10，加样于凝胶孔中，同时在相邻孔加入3μl TU-11，在100V 电压下，1×TAE液中电泳20min，在紫外成像仪下观察结果。
【结果判定】
在295bp 位置出现扩增带，实验结果为阳性（如图）。
【注意事项】
1. 每次使用，开盖之前请先瞬时离心，使试剂沉于管底。
2. 所有试剂在要求温度下保存，尽量减少反复冻融，使用后的试剂应立即放回。
3. 本试剂盒为10头份量试剂，加样和反应程序严格按照说明书进行，由于操作失误、移液器不精确、定时不准确造成无结果情况，不予负责。
4. 吸头、离心管和PCR管在使用前，应高压灭菌。
5. 注意防止试剂污染，在有效期限内用完。
6. TU-9所装试剂为致癌物质，避免接触到皮肤。如若不甚接触，请立即用洗涤剂清洗。
[有效期] 本制品有效期为1年，生产日期见包装侧面。
[联系人] 王金良、管宇 电话：0543-3403060
仅供兽医诊断使用
1. 每次使用，开盖之前请先瞬时离心，使试剂沉于管底。
2. 所有试剂在要求温度下保存，尽量减少反复冻融，使用后的试剂应立即放回。
3. 本试剂盒为10头份量试剂，加样和反应程序严格按照说明书进行，由于操作失误、移液器不精确、定时不准确造成无结果情况，不予负责。
4. 吸头、离心管和PCR管在使用前，应高压灭菌。
5. 注意防止试剂污染，在有效期限内用完。
6. TU-9所装试剂为致癌物质，避免接触到皮肤。如若不甚接触，请立即用洗涤剂清洗。
[有效期] 本制品有效期为1年，生产日期见包装侧面。
[联系人] 王金良、管宇 电话：0543-3403060
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编辑：熊方方
